“文献精读系列”是脊柱脊髓损伤再生修复教育部重点实验室举办的常规科研交流学习会议，旨在聚焦领域内前沿进展，探究学术尖端技术研究路线，培养锻炼青年科研人员与硕博生科研思维。

【文献精读】会议日期：2024年1月31日    审校人：朱颜菁    报告人/撰稿人：周超辰    编辑：宋思敏

水凝胶是一种具有生物降解性和模仿组织机械性能的材料，而基于蛋白质的水凝胶因为其可调节的生化性能而备受关注，但是一般的蛋白质水凝胶是基于分子间的化学交联形成的网络来维持的，这些蛋白质水凝胶通常是软的，其杨氏模量小于10KPa，他们在模仿软的组织，如肌肉上能表现的很好，但是对于软骨而言，其杨氏模量甚至能达到几个兆帕，这使得蛋白质水凝胶在模仿和承载软骨时表现欠佳，此外，软骨在具有高刚性的同时还能保持高韧性并能从形变中快速恢复过来，这些物理性质通常的矛盾的，这使得在合成水凝胶中模拟这些力学特性是具有挑战性的。

2023年6月21日，哥伦比亚大学化学系李宏斌教授、南京大学医学院蒋青教授合作在Nature上发表了题为“Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement”的研究论文。该研究通过在水凝胶中构建蛋白质之间的纠缠网络，合成了一种与软骨力学性质类似的蛋白质水凝胶，其在修复软骨损伤上表现良好。这一发现对于生物材料力学性质工程化调整提供了创新性方法，同时为软骨缺陷修复领域带来了新的可能。

为了在不改变蛋白质水凝胶的组分的同时增强蛋白质水凝胶的硬度，研究人员在FL蛋白八聚体（FL₈）溶液中，化学变性FL₈使得其强制展开折叠结构，并使得展开的蛋白链之间相互纠缠在一起（D-DC水凝胶）。

图1 N-DC水凝胶的合成方法及荧光图

而为了在保持其硬度的同时增强其韧性，研究人员将变性后的水凝胶重新复性（N-DC水凝胶），使得未纠缠的FL₈蛋白结构重新折叠，折叠的蛋白在收到外力的时候能够展开耗散吸收的能量，从而增强蛋白质水凝胶的韧性。

研究人员通过拉伸-松弛实验以及压缩-松弛实验测试了N-DC水凝胶的力学性质，发现其硬度和韧性远远超过普通的水凝胶，并且在连续加载-卸载试验中表现出良好的疲劳抗性，同时可以能够在形变后快速恢复其原始形状。

在拉伸-松弛实验以及压缩-松弛实验中，N-DC表现出了较大的滞后性，这说明其具有高效的能量损耗机制，从而带来了较高的韧性。

图2 N-DC水凝胶的力学性能测试结果

总之，N-DC具备和软骨类似的高刚性、高韧性、高循环寿命和快速回复能力，为了验证N-DC在软骨修复领域的应用价值，他们进行了体内外的修复实验。首先，他们在FL8中插入了整合素结合的RGD序列，这样构建的水凝胶（N-DC FLRGD）具有良好的细胞粘附性。

图3 水凝胶体外培养细胞荧光免疫图

体外实验表明，N-DC FLRGD水凝胶具有生物相容性，并支持细胞粘附、扩散和增殖。此外，N-DC FLRGD水凝胶提供了一种坚硬的成骨基质，以支持小鼠骨祖细胞MC3T3-E1向成骨细胞的分化，与坚硬基质（模量>25 kPa）促进成骨分化结果一致。

随后，研究人员在兔模型中测试了N-DC FLRGD水凝胶作为骨软骨缺损修复支架的效果，柔软的N-NC FLRGD/明胶水凝胶（Y = 35 kPa），坚硬的N-DC FLRGD水凝胶（Y＝0.21 MPa）和空白对照组。在植入后12周，坚硬的FLRGD水凝胶组的骨软骨缺损得到显著修复，但在对照组和柔软的FLRGD/明胶水凝胶组中则未观察到修复。

图4 不同条件软骨损伤修复结果

空白和软水凝胶组的缺损被不规则和凹陷的再生组织填充，与周围软骨明显区分。相比之下，坚硬水凝胶组中的再生组织被光滑且光滑的膜覆盖，接近天然软骨。国际软骨修复协会（ICRS）评分也证实了这些结果。

图5  12周时不同条件下软骨损伤修复的组织学分析

组织学结果显示，坚硬水凝胶组的骨和软骨缺损被均匀光滑的再生组织填充，并显示出与天然软骨相同的垂直排列的软骨细胞。相比之下，在空白和软水凝胶组中观察到明显的间隙和空腔。再生区域的细胞外基质显示出透明的软骨明显再生和糖胺聚糖的积极产生。

总之，该项工作展示了一种N-DC水凝胶化方法来工程化刚性和韧性蛋白质水凝胶。一方面，链缠结增强了水凝胶的刚度，而不会使网络变脆。另一方面，球状蛋白质的强制展开允许有效的能量耗散，而重新折叠则涉及快速恢复。这些效应协同作用，使高刚度、高韧性、快速恢复和高抗压强度集成到蛋白质水凝胶中。研究的结果显著扩展了蛋白质水凝胶可以实现的机械性能范围，并为进一步系统性探索刚性和韧性蛋白质水凝胶在生物医学工程中的潜在应用开辟了新道路。

参考文献：

Fu L, Li L, Bian Q, Xue B, Jin J, Li J, Cao Y, Jiang Q, Li H. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 2023;618(7966):740-747.